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ZT:俄罗斯政府文件:新冠病毒非天然形成


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俄罗斯政府文件:新冠病毒非天然形成

                                                                                           刘永                                                                                                                                                                                                                     

大卫深观察                                                            

 

                                                                             

                                

 

俄罗斯联邦在网站上发布的一则文件,名字是《预防诊断治疗新型冠状病毒(2019-NCOV)》。第一版发表于1月29日。

2月3日还发表了第二版,是根据第一版改编,但是相关内容在第二版中,并没有太大变化。

一共是51页。文件是俄罗斯联邦官方网站上,双签名,是俄罗斯卫生部部长和俄罗斯联邦消费者保护局的局长。

俄罗斯是一个从法律,从各种文件非常严肃、非常严密的一个国家。俄罗斯对医疗法和医生负责抓得非常严。医疗事故有专门的法庭,就是医疗事故法庭。出现这种新型的传染病,会产生大规模的这种影响、治疗,产生以后的这种医疗事故,去怎么评判,所以他们急于必须出这么一个文件。

在一开始,序言当中,所有文件当中使用的材料、数据,来自于世界卫生组织的专家,美国、中国、欧洲,都是分部中心,他们公布的官方数据。也就是所有他们这里面出现的数据、说法的基础。

它非常严谨地描述了现在冠状病毒是一个什么样的东西。报告认为,新型冠状病毒,是一种由蝙蝠的冠状病毒和未知来源的冠状病毒,重新综合组成的病毒,并且,它的基因排列顺序,有70%跟SARS是相吻合的。也就是说它明确阐述,它不是天然来源,不是人类至今所知道的,天然来源的这种产物,它是一个综合体。

至今为止,所有研究发现,人感染冠状病毒后产生的抗体,是极其不稳定的。而且,很容易重新被感染。也就是说,你感染了冠状病毒,自己用身体抗过去之后,并不代表你已经产生了冠状病毒的抗体,也不代表你不会再被感染了。

这说明让武汉这些康复者用血浆治感染者,这很恐怖的一件事情。

第一,取人的血液,这些人好了多长时间,是刚好的,还是好了一段时间的,这个差别都非常大。人刚好,有可能,现在他还没有重新感染。如果他好了一段时间之后,比如说,他好了两个星期三个星期之后了,再去给别人注射血液,他这个血液有没有用。

第二,给患者注射进去血液之后,这些病人有好转,他在24小时之内、48小时之内有好转,那么两个星期、一个星期之内他好没好?

这些东西是最关键的。所谓的好了,就是表现没了,症状没了。正常是因为什么,就是他体内产生的抗体足够抑制住他体内存在的新型冠状病毒。但这里,他的抗体不稳定。这个新产生的抗体,一旦分解,那体内存在的冠状病毒,就可以重新侵袭身体,人又感染了。也就是人类所知道的冠状病毒,它的表象是这个样子。冠状病毒的来源属于这一科这一类,但除了这一类之外,新型冠状病毒会不会有其它的,或者更强烈的,或者变异的其它东西呢?如果从这个角度来看来讲,很难做一个定义,就是说疫情过去了,疫情已经出现转折了,但从科学角度来讲,很难确定。

然后报告还说,什么样的人容易得病。20%是糖尿病,15%是高血压,其它心血管疾病的是15%。

中国卫生组织注册的数据当中,有25%转重病例,这25%细分为:16%重病人,5%危病人,4%死亡病人。

综上所述,目前俄罗斯的官方文件,也认为,这种新病毒不是天然形成,而是SARS冠状病毒与另外病毒的一种结合体。

因此,这也就能解释,为什么这个新病毒像怪物一样,成了一种人类从未对付过的一种怪物。

《柳叶刀》:携带病毒者可以是“健康人”

权威医学杂志《柳叶刀》2月13日,又发表了北京301医院医师常德等人的论文,标题是“保护卫生保健工作者免受亚临床冠状病毒感染”。这里的亚临床指的是,感染新病毒但没有症状的患者。

这次疫情之所以难控制,是因为很多重症,到死都没有症状,连发烧都没有,所以防不胜防。

《柳叶刀》的新论文,它其中点出了至少新病毒的3个可怕之处:

第一,没有症状的人也可以高效传播新病毒;

第二,从急性疾病中恢复后仍会大量携带病毒并继续感染他人;

第三,传统的保护措施,例如口罩,已无法提供足够的保护,因应新病毒可能护目镜、隔离服都得上。


国内不同角度 国际更多声音

 

 

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  • Pascal

    俄國衛生部長穆拉伸科(圖左)簽名文件認定武漢肺炎病毒來自人為重組,並宣布20日起禁止中、港、澳籍人士入境。(圖片來源/俄羅斯衛生部影片)

    武漢肺炎疫情延燒,俄羅斯日前關閉中俄邊界,取消中客免簽、停發工作簽證後,俄羅斯主管衛生事務副總理高里可瓦18日進一步表示,將自20日起禁止所有中國公民入境,對象包括香港人和澳門人,此舉可能和1月底俄國衛生部的一篇報告有關,該結論也於2月11日正式在俄國衛生部官網上公告「武漢肺炎病毒是重組的病毒,非天然形成」(報導中有附上原始俄文報告超連結)。

    中國武漢肺炎爆發至今,各國科學家紛紛指控該病毒基因遭到人工重組,非自然演化而成,意即這是發生在中國的人工生化武器。

    《信傳媒》持續報導病毒非自然形成,例如最早引證在1月27日的華人媒體《路德社》指出是舟山蝙蝠病毒合成,到印度學者發表被植入愛滋病毒一部分基因,到最近美國生物基因分析專家里昂斯維勒(James Lyons-Weiler)日前受訪時表示,新型冠狀病毒有使用「P-Shuttle SN Vector」的人造技術,基因組序列裡被插入奇怪的元素,不可能存在於任何地方的野生動物體內,他確定這個特別的病毒來自於實驗室。

    俄國衛生部認證病毒,宣布禁中國人入境

    中國官方當然否認,最近甚至有所謂的一百位跨國學者在最新一期的世界知名醫學期刊柳葉刀(The Lancet)上聯名支持中國政府,反駁病毒來自人工合成之說,(類似2019年百位美國企業家上書川普總統反對與中國脫鉤)然而,與中國長期友誼的俄國官方卻不這麼認為。

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  • Pascal

    摘要: 实际上,五年前中美病毒科学家通过实际提取、鉴定后又制造出了类Sars新冠病毒的过程,已预知新冠病毒极强传播性的社会风险,而当时所有预知的内容也都与本次发生的疫情状况高度相似。

    人体新冠病毒(Coronavirus)渲染图(来源:科学图片库)

    由中国武汉开始爆发的新型冠状病毒肺炎疫情持续引发关注,从 1 月 21 日开始证实新冠病毒肯定有“人传人”之后,一场全民参与的抗疫战役在中国,乃至世界正式打响。目前已知 2019 年 12 月开始,从第一起华南海鲜市场病例被证实,与SARS冠状病毒极为类似的“不明病毒肺炎”新型冠状病毒开始蔓延。

    但是钛媒体最近在仔细研究和整理新冠病毒相关研究时也发现,其实早在 5 年前,也就是 2015 年,美国病毒学家牵头联合中国病毒专家就曾合作成功提取和鉴定出了一种类SARS新型冠状嵌合病毒,并且之后又人工制造和培养出了一种SARS新型冠状重组病毒。这次的研究成果也被发表在了2015年的国际顶级科学杂志《Nature》上(下称:Nature论文)。

    在今年武汉爆发的新冠病毒肺炎发生之时,回过头来再看这份五年前的研究报告,依然颇觉触目惊心。虽然并不能证明五年前的研究发现和本次发生的武汉肺炎病毒是完全同一的病毒,但是的确都是与Sars极为相近的新冠病毒,在今年1月,有专家认为本次“不明肺炎”疫情,传播速度快、重病率高、难以"防控”的态势,是世界首次发生的时候,实际上,五年前就早有发生,而病毒科学家也早有预知,并且所有预知的内容都与本次发生的疫情状况高度相似。

    这份研究报告由美国学者和中国学者联合完成,作者包括美国德克萨斯大学医学分校微生物与免疫学系 教授Vineet D. Menachery ,中科院武汉病毒研究所研究员石正丽(Zhengli-Li Shi)等人,提取发现并又制造培养了一种嵌合型 SARS样 的新型冠状病毒,根据论文所述,该病毒能让小鼠感染上 SARS(非典肺炎),也可以证实这一病毒通过蛋白外壳与体内 RNA 进行结合,感染和传递到人类细胞当中,报告结论就是这种类Sars新冠状病毒,因其高度可人际传播的属性,可能会给人类带来巨大的社会风险。

    五年前的预言一语成谶,同时这份研究报告也说明,本次武汉疫情可能不是偶然的,类Sars冠状病毒的变异和传播从未停止,但人类并未重视。正如近日,北卡罗来纳州吉林斯大学全球公共卫生学院的冠状病毒专家兼助理教授蒂莫西·谢汉(Timothy Sheahan)评价武汉新冠肺炎所说,“这不是“一次性”的病毒疫情,很可能会在未来持续发生。”

    针对近期沸沸扬扬的关于武汉病毒研究所的猜测和争议,石正丽在其朋友圈发表声明称:“以生命担保,2019新冠病毒与实验室无关,这是大自然对人类不文明生活习惯的惩罚”。

    武汉病毒研究所研究员石正丽

    2015年到底发生了什么?

    2015年的Nature论文中阐述了一个背景,即当时在中国有一个叫做马蹄蝠的蝙蝠种群,这是一种在岩洞栖息地里的菊头蝠科蝙蝠群体,它们体内正在流行一种类似SARS的病毒——SHC014-CoV,而当时严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS)-CoV的出现,突出了跨物种传播事件对人类社会的威胁,故而科学家们希望研究在马蹄蝠中流行的这一病毒的致病潜力。

    蝙蝠是许多病毒的自然宿主,包括埃博拉病毒、马尔堡病毒,狂犬病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒等。由于蝙蝠特殊的免疫系统,携带病毒却极少出现病症。在漫长的进化历程中,蝙蝠成为了上百种病毒的自然宿主。对于病毒溯源的研究来说,蝙蝠地位很特殊,是重点的关注对象。

    中国科研人员已发现,蝙蝠体内一个被称为“干扰素基因刺激蛋白-干扰素”的抗病毒免疫通道受到抑制,这使得蝙蝠刚好能够抵御疾病,却不引发强烈的免疫反应。野生蝙蝠可能会携带很多病毒,但是它们都维持在一个较低的水平上。

    于是,Vineet D. Menachery教授等利用SARS-CoV的反向遗传系统,从中提取并鉴定了一种嵌合病毒,该病毒在适应小白鼠的SARS-CoV主干中可表达出蝙蝠冠状病毒SHC014的刺突。结果表明,该新型冠状病毒能利用SARS的人类细胞受体——血管紧张素转换酶II(ACE2)的多个同源基因,在人类呼吸道原代细胞中有效复制,并在体外获得与SARS传染性同等的效果。

    此外,体内实验证明,该嵌合病毒被复制在小白鼠肺部后,可导致明显的发病征状。评估显示,现有的基于SARS的免疫治疗和预防模式的效果不佳;单克隆抗体和疫苗方法均未能利用这种新的刺突蛋白来中和免疫CoVs感染。

    基于以上这些发现,上述科学家们最终成功合成了一株具有感染性的全长SHC014重组病毒,并同时在体外和体内证实了该病毒的强大复制能力。研究结果表明,这种病毒完全可重现SARS-CoV(SARS冠状病毒)的传播风险。

    Nature论文三种范例所证明的新冠病毒传播原理,与武汉疫情高度类似

    以下都来自钛媒体编辑翻译并整理了上述2015年《Nature》论文中的主要分析内容,传播原理的确与本次武汉新冠肺炎类似,很多结果也类似,例如关于致病性不会比Sars冠状病毒增强、人传人潜在风险极大(传染性大)、老年动物(实验主要以动物进行实验)更易感等。

    高致病性冠状病毒SARS冠状病毒的出现,预示着严重呼吸疾病跨物种传播的新时代。全球化为病毒的快速传播带来基础,对全球经济有着巨大影响。

    在SARS席卷全球后,甲型流感亚型病毒H5N1、H1N1和H7N9以及MERS冠状病毒(中东呼吸综合征)开始出现,并且可以同样通过动物传染人类,对当地人口带来了死亡的阴影以及经济损失。

    尽管公共卫生措施控制了SARS冠状病毒的爆发,但最近的宏基因组研究通过识别近期在中国马蹄蝠中大面积流行的类SARS冠状病毒的病毒序列,发现这些由蝙蝠携带的病毒有可能在未来带来更多的威胁。

    但是,病毒序列带来的数据只能为将来识别以及预防类似流行性病毒提供非常有限的洞见。因此,为了分析蝙蝠携带的冠状病毒引起流行性传播的可能性(也即是传染人类的可能性),我们提取了中国马蹄蝠携带的RsSHC014冠状病毒序列中可造成人畜传染的冠状病毒刺穿蛋白,使用适应小白鼠的SARS冠状病毒主链培育出了一种嵌合病毒。

    培育出来的混合病毒让我们能够评估该刺穿蛋白在没有经过自然适应性变异的情况下感染人类的能力。通过这个方法,我们对人类气道细胞在活体状态下由SHC014冠状病毒导致的感染特征进行了分析,测试了现有的免疫和治疗方法对SHC014冠状病毒的作用。这个研究方法能对宏基因组学数据进行解读,帮助预防未来可能会出现的病毒,并未将来疫情爆发的可能性做好准备。

    SHC014和相关的RsWIV1冠状病毒的序列显示,该类冠状病毒为SARS冠状病毒(图示1a,b)的近亲。但是,SHC014和SARS冠状病毒在结合人类的14残基和SARS冠状病毒受体中存在差异。受体包括5个决定宿主范围的残基:Y442、L472、N479、T487和Y491 。在WIV1中,其中三个残基与Urbani SARS冠状病毒不同,按原本预期,它们不会改变和ACE2的结合。

    这一情况由两个假型化实验得到证实。其中一个实验测试了慢病毒属WIV1刺穿蛋白进入细胞释放血管紧张素转换酶II(AC2)的能力。另一实验为复制WIV1冠状病毒(ref. 1)的试管实验。在SHC014中存在14个与ACE2有相互作用的残基,其中有7个残基和SARS冠状病毒的不一样,这包括了所有5个对决定宿主范围起关键作用的残基。

    这些变化,以及释放SHC014刺穿蛋白进入细胞的慢病毒假型实验,表明SHC014刺穿蛋白无法与人类的ACE2进行结合。

    但是,有研究发现,其他相关的SARS冠状病毒株存在类似变化,这意味着我们需要做进一步的功能测试才能做出更好的判断。因此,我们基于复制功能强、实应小白鼠的SARS冠状病毒主链合成了SHC014刺穿蛋白(该嵌合冠状病毒在后文统称为SHC014-MA15),以研究小白鼠的发病机理和疫苗研究。与现有分子建模和假型实验得出的预测不同,SHC014-MA15保持了活性,并且在Vero细胞中复制致高滴度。

    类似于SARS病毒,SHC014-MA15同样需要功能正常的ACE2分子才能进入细胞,并且可以使用与人类、果子狸和蝙蝠直系同源ACE2。为了测试SHC014刺穿蛋白感染人类气道的能力,我们研究了人类上皮气道细胞系Calu-3 2B4对感染的敏感性,发现SHC014-MA15具有强大复制能力,与Urbani SARS病毒相当。

    除此之外,人类主要气道上皮(HAR)培养物被感染,两种病毒都展现出了强大的复制能力。总之,这些数据证实了带有SHC014的病毒感染人类气道细胞的能力,并显示出了SHC014冠状病毒具备跨物种传播的潜在威胁。

    图|SARS 样的冠状病毒在人类气道细胞中复制并产生体内的发病机理为了评估SHC014次突蛋白在体内介导感染中的作用,我们用104个SARS-MA15或SHC014-MA15空斑形成单位 (p.f.u.)感染了10周大小的BALB/c小白鼠(图1e-h)。

    感染SARS-MA15的白鼠在感染后第4天出现体重迅速下降和死亡现象(d.p.i.);而感染了SHC014-MA15的小白鼠体重下降显著(10%),但无死亡(图1e)。

    对病毒复制的检测显示,感染了SARS-MA15或SHC014-MA15的小鼠肺部病毒滴度几乎相同(图1f)。感染了SARS-MA15的小白鼠的肺的末梢细支气管和肺实质(图1g)均有较强程度的染色(图1g),而被SHC014-MA15感染的小白鼠的肺抗原染色较弱(图1h);与此相反,在软组织或整体组织评分中未发现抗原染色缺陷,这表示肺部组织对SHC014-MA15的感染情况有异(补充表2)。

    感染SARS-MA15的动物体重迅速下降,并死于感染(补充图3a,b)。感染SHC014-MA15可导致动物体重显著下降,但致死率极低。在年轻小白鼠中观测到的组织学和抗原染色模式,在年长些的白鼠中也可观测到(补充表3)。我们使用Ace2−−老鼠进行实验,排除了SHC014-MA15通过另一种感染受体传播的可能性。

    该种情况下,小白鼠没有体重下降,或被SHC014-MA15感染后的抗原染色现象(补充图4 a, b和补充表2)。以上这些数据表明,具有SHC014刺突的病毒能够在CoV病毒主干的条件下致使小白鼠体重减轻。

    考虑到埃博拉单克隆抗体疗法(例如 ZMApp 10)的临床功效,我们接下来试图确定 SARS-CoV 单克隆抗体对抗 SHC014-MA15 感染的功效。广泛中和针对 SARS 冠状病毒刺突蛋白已经被先前报道,并且是免疫试剂可能人类单克隆抗体。

    我们检查了这些抗体对病毒复制的影响(表示为病毒复制的抑制百分比),发现野生型 SARS-CoV Urbani 在相对较低的抗体浓度下被所有四种抗体强烈中和,SHC014-MA15的中和效果有所不同。通过噬菌体展示产生的和逃避突变型的抗体,仅实现抑制 SHC014-MA15 复制(如图 2a)。同样,源自 SARS-CoV 感染患者的记忆 B 细胞的抗体 230.15 和 227.14 也未能阻止SHC014-MA15复制(图 2b,c)。

    对于所有三种抗体, SARS 和 SHC014 尖峰氨基酸序列之间的差异对应于 SARS-CoV 逃逸突变体(fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E)中发现的直接或相邻残基变化,这可能解释了抗体的缺失针对SHC014的中和活性。

    最后,单克隆抗体 109.8 能够实现 SHC014-MA15 的 50% 中和,但仅在高浓度(10μg/ ml)时(图2d)。总之,结果表明,针对 SARS-CoV 的广泛中和抗体可能仅对新兴 SARS 样 CoV 菌株(如 SHC014)具有边际功效。

    图|SARS-CoV单克隆抗体对SARS样CoV的疗效折线图为了评估现有疫苗抵抗 SHC014-MA15 感染的功效,研究人员用双重灭活的完整 SARS-CoV(DIV)疫苗接种了老年小鼠。先前的工作表明,这种疫苗接种方式可以中和并保护年轻小鼠免受同源病毒的攻击;然而,该疫苗未能保护其中还观察到增强的免疫病理的老年动物,这表明由于疫苗接种,动物受到了伤害。在这里,我们发现 DIV 不能在体重减轻或病毒滴度方面提供 SHC014-MA15 的抗攻击保护(图5a,b)。与其他异源组 CoV 的先前报告一致。此外,来自接种 DIV 的老年小鼠的血清也未能中和 SHC014-MA15(如图5c)。

    值得注意的是, DIV 疫苗接种导致了强大的免疫病理和嗜酸性粒细胞增多。这些结果证实,DIV 疫苗不能预防 SHC014 感染,并且可能增加老年接种组的疾病。

    与用 DIV 疫苗接种相比,将 SHC014-MA15 用作减毒活疫苗显示了针对 SARS-CoV 攻击的潜在交叉保护作用。论文当中的研究人员表示,其用 10 4pfu 的 SHC014-MA15 感染幼鼠,并观察了 28 天。然后,在第 29 天,他们用 SARS-MA15 攻击了小鼠。

    尽管在 SHC014-MA15 感染后28 天内产生的抗血清,只有极少的 SARS-CoV 中和反应,但先前用高剂量 SHC014-MA15 感染的小鼠可防御致命剂量的 SARS-MA15 攻击。

    在没有二级抗原升压的情况下,28 dpi 表示的抗体滴度的预期峰值,意味着有将随时间而减少针对 SARS-CoV 的保护。在体重减轻和病毒复制方面,在衰老的 BALb/c 小鼠中观察到了类似的结果,表明用致死剂量的SARS-CoV攻击具有保护作用。然而,在某些老年动物中,SHC014-MA1 5感染剂量为 10 4pfu,导致体重减轻和致死率> 10%。

    研究人员发现,以较低剂量的 SHC014-MA15(100 pfu)进行疫苗接种不会诱导体重减轻,但也无法保护老年动物免受 SARS-MA15 致命剂量的攻击。总之言之,根据论文的说法,数据表明,SHC014-MA15 攻击可能通过保守的表位赋予针对 SARS-CoV 的交叉保护作用,但所需剂量可诱发发病机理,并不能用作减毒疫苗。

    确定 SHC014 尖峰具有介导人类细胞感染并引起小鼠疾病的能力后,我们接下来基于用于SARS-CoV的方法合成了全长SHC014-CoV感染性克隆。在Vero细胞中复制显示SHC014-CoV相对于SARS-CoV没有缺陷;然而,在感染后24小时和48小时,原代HAE培养物中SHC014-CoV显着减弱(P <0.01)。

    与SARS-CoV Urbani相比,小鼠的体内感染没有显示出明显的体重减轻,但在全长SHC014-CoV感染的肺部显示出病毒复制减少。总之,这些结果确定了全长SHC014-CoV的生存力,但表明其复制必须与人类呼吸道细胞和小鼠中流行的SARS-CoV的复制相一致,需要进一步的适应。

    图|SHC014-CoV在人呼吸道中复制,但缺乏流行性SARS-CoV的毒力在 SARS 冠状病毒流行期间,人们很快发现了棕榈科动物和人类冠状病毒之间的联系。基于这一发现,有两种不同观点范例表述。其中,第一种观点认为,流行性 SARS-CoV 起源于蝙蝠病毒,跃迁至小窝并在受体结合域(RBD)内引入了变化,以改善与麝猫 Ace2 的结合,随后在活畜市场上接触人,使人感染了麝香毒株,而该麝香毒株又适合成为流行毒株。

    但是,根据发育周期以及数据分析表明,早期人类SARS菌株与蝙蝠菌株的关系似乎比灵猫菌株更为紧密。因此,第二种观点认为蝙蝠直接传播导致SARS-CoV的出现,而棕榈科动物则是继发宿主和持续感染的宿主。对于这两种范例,都认为必须在二级宿主中适应峰值,因为大多数突变预计会在RBD内发生,从而有助于改善感染。两种理论都暗示蝙蝠冠状病毒的库是有限的,宿主范围的突变既是随机的又是罕见的,从而降低了人类未来出现突发事件的可能性。

    图|冠状病毒的出现(传播)范例尽管Nature论文表示,这一新的研究,并未打破上述说法与范例,但也的确提出了第三种范式,这一论文的作者团队认为,蝙蝠 CoV 病毒细胞为了保持“平衡”的刺突蛋白,能够在不突变的情况下感染人类。通过在SARS-CoV主链中包含SHC014刺突的嵌合病毒在人气道培养物中和在没有RBD适应的小鼠中引起强烈感染的能力可以说明这一假设。

    加上以前鉴定的致病冠状病毒主链的观察,上述论文研究结果表明,SARS 样菌株所急需的原材料目前正在动物水库中流通。值得注意的是,尽管全长SHC014-CoV可能需要额外的骨架适应性来介导人类疾病,但有记录的CoV家族中的高频重组事件强调了未来出现的可能性和进一步准备的必要性。

    迄今为止,动物种群的基因组学筛选已主要用于鉴定暴发环境中的新型病毒。这里的方法将这些数据集扩展为检查病毒出现和治疗功效的问题。我们认为,具有SHC014尖峰的病毒由于其在原代人类气道培养物中复制的能力而成为潜在的威胁,这是人类疾病的最佳可用模型。另外,在小鼠中观察到的发病机制表明含有SHC014的病毒能够在没有RBD适应的情况下在哺乳动物模型中引起疾病。

    值得注意的是,相对于SARS-CoV Urbani,与SARS-MA15相比,肺中的向异性和HAE培养物中全长SHC014-CoV的衰减相对于SARS-CoV Urbani而言,提示了ACE2结合以外的因素-包括穗突性,受体生物利用度或拮抗宿主免疫反应中的一部分可能有助于出现。然而,需要对非人类灵长类动物进行进一步测试,以将这些发现转化为人类致病潜能。重要的是,现有治疗方法的失败定义了进一步研究和开发治疗方法的关键需求。有了这些知识,就可以产生监视程序,诊断试剂和有效的治疗方法,从而防止出现组别特异性CoV,例如SHC014,并且可以将其应用于维护相似异质库的其他CoV分支。

    在以前出现的模型的基础上,研究人员认为,新型冠状病毒并没有增强致病性。作者表示,预计不会产生嵌合病毒(例如SHC014-MA15)会增加致病性的情况。虽然SHC014-MA15相对于其亲本小鼠适应的SARS-CoV减毒,但类似的研究检查了MA15骨架内野生型Urbani尖峰的CoV的致病性,显示小鼠无体重减轻,病毒复制减少。因此,相对于Urbani峰值–MA15 CoV,SHC014-MA15的发病机理有所改善。

    基于这些发现,科学评论小组可能认为类似的研究基于无法冒险进行的循环株构建嵌合病毒,因为不能排除哺乳动物模型中致病性的增加。再加上对小鼠适应株的限制以及使用逃逸突变体开发单克隆抗体的研究,对CoV出现和治疗功效的研究可能会严重受限。这些数据和限制加在一起,代表了新冠病毒研究关注的十字路口。在制定前进的政策时,必须权衡准备和缓解未来爆发的潜力与创造更多危险病原体的风险。

    总体而言,研究人员利用实验和分析,对已使用宏基因组学数据来识别由循环蝙蝠SARS状CoV SHC014构成的潜在威胁。由于嵌合的SHC014病毒在人气道培养物中复制的能力,在体内引起发病机理并逃避当前的治疗方法,因此需要针对循环的SARS样病毒的监视和改进的治疗方法。我们的方法还可以利用宏基因组学数据来预测病毒的出现,并将这些知识应用于准备治疗未来出现的病毒感染。

    培养并制造出新冠病毒的实验过程

    以下是钛媒体编辑整理了上述论文中科学家们培养并制造出一种新型冠状病毒的实验过程,这一过程被称为“病毒,细胞,体外感染和噬菌斑测定方案”。

    科学家将从美国陆军传染病研究所获得的野生型 SARS-CoV(Urbani),适应小鼠的 SARS-CoV(MA15)和嵌合型 SARS 型 CoV 病毒细胞在 Vero E6 培养基细胞上。据悉,这一细胞是根据美国病毒学家杜尔贝科(Dulbecco,Renato) 所研制出改良的 Eagle's 培养基上生长。

    另外,获得到的病毒细胞组织,是通过之前研究的信息进行的,其中包括表达 ACE2 直向同源物的 DBT 细胞(Baric实验室,来源未知),这些都在先前被描述为人类和麝猫感染的细胞组织,ACE2 序列是基于从菊头蝠,就是蝙蝠 DBT 细胞当中提取,并从中建立新的病毒培养。

    作者表示,这一实验本身是伪型实验过程,与使用基于 HIV 的伪病毒实验类似,先前使用武汉病毒研究所提供的 ACE2 直系表达的同源物种的 HeLa 细胞进行检查,HeLa 细胞在最低必需培养基补充有 10% FCS(Gibco公司,CA)以及 MEM(Gibco公司,CA)中生长,得出下图在Vero E6,DBT,将Calu-3和2B4原代人呼吸道上皮细胞的生长曲线。

    实验物,也就是仿制的肺,则是在北卡罗来纳大学机构审查委员会批准下采购的,而这种肺并不是活体的肺,是在 HAE 培养的人肺。该 HAE 培养物代表高度分化的人气道上皮,其中包含纤毛和非纤毛上皮细胞以及杯状细胞,培养物应在气液界面上生长数周,才拿到该实验当中。

    而后,将细胞用 PBS 溶液进行洗涤,并用病毒接种或在 37℃ 的 PBS 溶液中模拟稀释 40 分钟。将细胞洗涤 3 次,并加入新鲜培养基以表示时间 “0”。在每个所述的时间点收获三个或更多的生物重复样品,所有病毒的培养均在生物安全级别(BSL)为 3 级的实验室中进行。

    人员和环境方面,将冗余的生物细胞放进对应的安全柜中,并有电扇进行散热。所有人员都穿着特别的卫生强化防护服,为了实验过程的健康,相关科研人员使用 3M 电动呼吸器(Breathe Easy,3M)进行呼吸,并严格佩戴双手套,使得实验在安全状况下进行。

    序列聚类和结构建模

    实验中,从 Genbank 或 Pathosystems 资源整合中心(PATRIC)下载具有代表性的 CoV S1 结构域的全长基因组序列和氨基酸序列,并与 ClustalX 进行比对,通过系统分析使用 100 个自举法或使用 PhyML(https://code.google.com/p/phyml/)封装。

    事实上,这一过程主要是将数据进行比对,对病毒的未来变异进行管控,形成一定的数据模型。

    接着,科研人员使用 PhyML 软件包生成最大可能性数值树。比例尺代表核苷酸取代。仅标记引导程序支持高于 70% 的节点。该树显示 CoV 分为三个不同的系统发育组,分别定义为 α-CoV,β-CoV 和 γ-CoV。对 于β-CoV,经典子群群集标记为 2a,2b,2c 和 2d,对于 α-CoV,标记为 1a 和 1b。使用 Modeller(Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit)生成结构模型,以基于晶体结构 2AJF(蛋白质数据库)生成 SARS RBD 的 SHC014 和 Rs3367 与 ACE2 的同源性模型。在 MacPyMol(1.3版)中可视化和操作同源模型。

    SARS样嵌合病毒的构建

    如前所述,野生型和嵌合病毒均来自 SARS-CoV Urbani 或相应的小鼠适应性(SARS-CoV MA15)感染性克隆(ic)病毒细胞。通过提取含有 SHC014 刺突序列的质粒,并连接到 MA15 感染性克隆的 E 和 F 质粒中。设计该克隆并从 Bio Basic 购买六种连续 cDNA,并使用侧接独特的 II 类限制性核酸内切酶位点(BglI)的公开序列。

    之后,研究人员对其扩增,切除,连接和纯化含有野生型,嵌合 SARS-CoV 和 SHC014-CoV 基因组片段的质粒。然后进行体外转录反应以合成全长基因组 RNA,如先前所述将其转染到 Vero E6 细胞中。收获转染细胞的培养基,并用作后续实验的种子库。在用于这些研究之前,通过序列分析证实了嵌合和全长病毒。嵌合突变体和全长 SHC014-CoV 的合成构建,这一新的 SARS样嵌合病毒标准,需要得到北卡罗莱纳大学机构生物安全委员会和关注双重用途研究委员会的批准。

    小鼠体内感染

    事实上,这份实验需要根据人体,来了解抵抗力以及病毒形成活动,多数据下,形成小鼠体内感染的数据分析。

    论文中称,其从 Harlan Laboratories 订购了雌性、10 周龄和 12 个月大的 BALb/c 白变种实验室老鼠。将动物带入 BSL3 实验室,并使其在感染前适应 1 周。对于感染和减毒活疫苗接种,将用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物对小鼠进行麻醉,并在鼻腔感染时用 50μl 磷酸盐缓冲液(PBS)或稀释的病毒经鼻内感染,每个时间点,每只三或四只小鼠,感染组每剂量都按照条件定量。对于个别小鼠,研究人员可以酌情决定是否将小鼠数据排除在外,包括不吸入全部剂量,鼻腔冒泡或通过口部感染引起的感染。

    感染后,在任何动物实验中均未使用致盲法,且动物未随机分组。对小鼠进行接种疫苗,通过足垫注射为年轻和老年小鼠接种 20μl 的含明矾或模拟 PBS 的 0.2μg 双灭活 SARS-CoV 疫苗;然后在 22 天后以相同的方案加强小鼠免疫体质。对于所有组,按照实验方案,在实验过程中每天监测动物的疾病临床体征(驼背,毛皮松动和活动减少)。在头 7 天里,每天监测体重是否减轻,此后继续进行体重监测,直到动物恢复至初始初始体重或连续 3 天显示体重增加为止。所有体重下降超过其初始体重 20% 的小鼠都被喂食并每天监测多次,只要它们处于 20% 的临界值以下即可。

    按照实验方案,立即处死体重超过其初始体重 30% 的小鼠。根据研究人员的说法,任何被认为垂死,或不太可能恢复的小鼠,将使用异氟烷过量进行安乐死,并通过颈脱位确认死亡,这种处理方式使用 UNC 机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案。

    组织学分析

    在实验结束后,取出左肺,浸没在 10% 福尔马林缓冲液(Fisher)中,不充气 1 周。将组织包埋在石蜡中,并由 UNC Lineberger 综合癌症中心组织病理学核心设施制备 5μm 切片。为了确定抗原染色的程度,使用市售的多克隆 SARS-CoV 抗核衣壳抗体(Imgenex)对切片进行病毒抗原染色,并以盲法方式对气道和实质进行染色,使用带有 Olympus DP71 相机的 Olympus BX41 显微镜捕获图像。

    病毒中和测定和统计分析

    在这一部分当中,噬斑减少中和效价测定法与先前表征针对 SARS-CoV 的抗体进行。简而言之,就是中和抗体或血清,并将其进行两次连续稀释,与 100pfu 不同感染性克隆 SARS-CoV 菌株在 37°C 温度下孵育 1 小时。然后将病毒和抗体以 5×10 5 孔 Vero E6 细胞添加到另一孔板中,并重复多次(n≥2)。

    在 37°C 下孵育 1 小时后,研究人员需要在培养基中铺上 3 ml 0.8% 琼脂糖。在将板在 37℃ 下孵育 2 天,用中性红染色 3 小时并计数噬菌斑。计算噬菌斑减少的百分比为(1-((带有抗体的噬菌斑数量/没有抗体的噬菌斑数量))×100。

    实验结束后进行统计分析,所有实验均与两个实验组(两种病毒,或已接种和未接种的队列)进行对比。因此,病毒的显著差异是通过在各个时间点进行检验确定的。最终的数据以正态分布,在每个比较的组别中,放置出相似的方差。(本文首发钛媒体App)

    https://tech.sina.com.cn/roll/2020-02-02/doc-iimxxste8313311.shtml

    https://cj.sina.com.cn/articles/view/5115326071/130e5ae7702000y7wq?from=finance

    Nature论文地址:

    https://www.nature.com/articles/nm.3985#auth-14

    参考来源:

    https://microbiology.utmb.edu/faculty/vineet-d-menachery-phd

    https://www.the-scientist.com/news-opinion/lab-made-coronavirus-triggers-debate-34502

    https://www.nature.com/articles/d41586-020-00262-7

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    1、“关于新冠病毒源于人工合成”之所,请贵所认真核实贵所研究员石正丽的论文——A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence发表于2015年11月9日(Published: 09 November 2015 )在该论文中提到“The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV.

    (该论文作者:Vineet D Menachery, Boyd L Yount Jr, Kari Debbink, Sudhakar Agnihothram, Lisa E Gralinski, Jessica A Plante, Rachel L Graham, Trevor Scobey, Xing-Yi Ge, Eric F Donaldson, Scott H Randell, Antonio Lanzavecchia, Wayne A Marasco, Zhengli-Li Shi & Ralph S Baric ”由于我不是专业人士,故只能看出大体意思是“只要把蝙蝠身上的S蛋白里头ACE2这个受体开头只要一调,这个病毒马上就可以传染给人”,请贵所进行公开澄清,这种研究是不是属于人工合成的一部分?在武汉肺炎之前,武汉病毒研究所及其研究员究竟进行了多少这样的研究?

    2、关于“病毒是从P4泄露的”之说:对于这个问题进行说明的更不应该仅仅是一封公开信就可以回应的,作为一家科研机构,我认为最科学的方法就是公开武汉病毒研究所的相关记录,这些记录包括但不限于(笔者注:详细内容参见毒是不是从武汉P4实验室泄漏需要用石正丽用生命担保吗) :

    1)、2019年10月27日至2020年12月19日期间所有防护服的使用、保管信息以及这些防护服的破损检查信息;

    2)、2019年10月27日至2020年12月19日期间武汉P4实验室的所有监控录像交由中国以外的第三方检查,只要中间有断点,那么就不能否认武汉P4实验室存在泄漏嫌疑;

    3)、2019年10月27日至2020年12月19日期间P4实验室的空气过滤设备工作状况记录、下水道加热消毒运转情况记录、固体废物焚烧记录;

    4)、2019年10月27日至2020年12月19日期间所有离开实验室的人员的防护服化学浴冲洗记录;

    5)、2019年10月27日至2020年12月19日期间所有离开办公室的研究所人员的接触史,重点查证有没有任何研究所的人员在七天内接触过任何家禽家畜;

    3、对于“军方接管P4”的说法,目前可以在网上查到的相关信息很多,本文仅举一例:中国首席生化武器专家陈薇少将接管武汉P4病毒实验室,如果这一说法不属实,建议武汉病毒研究所向发出此类信息的新闻机构及社交媒体发函,要求更正,而不是目前这种全世界都在关注武汉病毒所的情况下,仅对本所职工和研究生发公开信进行说明,只有在源头上进行澄清才能让“流言止于智者”。另外请武汉病毒研究所说明一下,负责武汉病毒研究所保卫任务的是不是武汉病毒研究所的普通雇员?还是中共军方总参保卫部的人员进行专门警卫?请武汉病毒研究所提供近四年来负责武汉病毒研究所保卫的人员花名册,以正视听。

    4、关于“某研究人员因病毒泄露死亡”“某研究生是‘零号病人’”之说:我相信针对这种说辞不必以某研究人员和某研究生的笼统说法进行模糊化处理,直接把信中提到的某研究人员和某研究生的详细情况进行说明即可,因为回应谣言的最好办法就是真相。

    5、对于“某研究员实名举报所领导”之说,这不应该是公开信答复的形式,如果是公开信答复的形式,那么应该说明针对某研究员实名举报所领导的情况,武汉病毒研究所是如何处理的、相关部门是如何处理的,既然是实名举报,那么完全可以对实名举报的处理情况进行公开回应,涉及案件信息不便披露的,也直接进行说明,我相信这才是科学的态度。

    6、对于武汉病毒研究所在信中提到的“2019年12月30日晚,我所收到武汉市金银潭医院送来的不明原因肺炎样品后,连夜组织力量、连续72小时攻关,于2020年1月2日确定新冠病毒的全基因组序列,1月5日分离得到病毒毒株,1月9日完成国家病毒资源库入库及标准化保藏,1月11日作为国家卫健委指定机构之一向世界卫生组织提交了病毒序列。同时,还在病原鉴定、病毒溯源、病原检测、抗病毒药物及疫苗研制、动物模型建立等方面开展了大量工作,取得了良好进展。此外,我所作为武汉市指定的机构之一,参与了新冠病毒肺炎病原学检测工作,自1月26日起,累计检测疑似新冠肺炎病人咽拭子样本约4000份,我所还派出了由职工和研究生组成的小分队,支援黄冈市病原学检测,为疫情防控工作尽心出力。”,

    希望武汉病毒研究所能够就以下事实进行说明:

    1)2020年01月24日 17:57 来源于财新网发表的解码新型冠状病毒:SARS的“近亲” 自然宿主或为蝙蝠提到的“一种新型冠状病毒nCoV-2019在武汉引起了急性呼吸综合征的流行。该疫情始于2019年12月12日,在疫情早期,石正丽团队从5名患者身上获得了该病毒的全长基因组序列,它们基本上一致。研究发现,nCoV-2019与SARS-CoV的基因序列一致性达79.5%。此外, nCoV-2019在全基因组水平上与一种蝙蝠中的冠状病毒的序列一致性高达96%。对7种非结构蛋白的成对蛋白序列分析表明,nCoV-2019属于SARSr-CoV。研究还发现,从一名危重病人的支气管肺泡灌洗液中分离出的nCoV-2019病毒,可被数名病人的血清中和。重要的是,该团队证实,这种新的冠状病毒进入细胞的受体与SARS-CoV一样,均为ACE2(人血管紧张素转换酶)。”

    据这篇报道,石正丽团队知道武汉肺炎疫情始于2019年12月12日,并且在疫情早期石正丽团队就从5名患者身上获得了该病毒的全长基因序列,这与武汉病毒研究所在本文提到的公开信中提到的“2019年12月30日晚,我所收到武汉市金银潭医院送来的不明原因肺炎样品后,连夜组织力量、连续72小时攻关,于2020年1月2日确定新冠病毒的全基因组序列,1月5日分离得到病毒毒株,1月9日完成国家病毒资源库入库及标准化保藏,1月11日作为国家卫健委指定机构之一向世界卫生组织提交了病毒序列。”自相矛盾,请问石正丽团队是不是属于武汉病毒研究所?另外请武汉病毒研究所确认财新报道中提到的石正丽团队获得得全长基因组序列与武汉病毒研究所在本文所提公开信中的基因序列是否是同一份?因为这牵扯到武汉病毒所没有提到的另一个颇受外界质疑的说法——

    2)中共先后三次向WHO等国际机构上传了武汉肺炎病毒的基因序列,而前两次是故意篡改了基因序列的。相关说法如下(据1/19/2020 路安艾时评:为什么财新胡舒立要一再否认武汉SARS病毒和舟山蝙蝠病毒的关联性?中共和该病毒有什么关系?该病毒是否已经进化具备人传人大爆发可能性?为什么中共要不断隐瞒确诊案例? ):

    在这一次武汉SARS爆发后,中共先后在2019年12月1日、2020年1月12日两次篡改提交给世界卫生组织(WHO)的武汉SARS病毒序列,在2020年1月14日向世界卫生组织(WHO)提交了最终的病毒序列。

    总之,作为一家中国最权威的病毒研究机构,我们希望武汉病毒研究所能够正视外界的质疑,并且以科学的态度和方法来澄清质疑。

                                             一名关心武汉病毒研究所的网友

                                              2020年2月20日

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  • 蒋大公子 回复 水蛇

    [

    俄罗斯媒体是最早提出,新冠病毒为美国制造。并一直坚持新冠病毒非来自野生动物。

    ] 俄国人的观点是正确的,新冠病毒的确为美国制造,不应该是加拿大制,造但是被中共盗窃到中国去了,中国武汉p4病毒所里面的病毒就是他们盗窃来的,当然后来泄露了,结果是害人害己。

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  • 蒋大公子 回复 我叫小龙鱼

    [

    【新唐人】??

    你一个轮子,有什么资格说话?满嘴谎言。] 遗憾的是,这个世界不是由你说了算,也不是由中共说了算,轮子在全世界都是合法组织,【新唐人电视】天天在网上播放,大纪元报纸天天发表,你说他们是满嘴谎言。他们也说你和中共是满嘴谎言。,我个人认为他们说的是对的,你和中共是满嘴谎言。他们不过是偶尔说谎。你和中共是无论何时何地都是满嘴谎言

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  • 蒋大公子

    [全球27位科学家和专家联名发表声明,证明新冠病毒非人工合成。其中就有不少美国科学家和专家。] 但是全球还有270位科学家和专家分别发表声明,证明新冠病毒是人工合成。其中也有不少美国科学家和专家。

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  • zhf

    AYA_, 你TMD傻逼。那些民主党活动积极分子加起来都没有床铺在中国投资多。

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  • AYA_

    美国有一批极左精英专门找机会跟川普总统对着干,你看一千多名前或现任检察官最近要求司法部长辞职声明还不被这个数字吓破胆?妖魔鬼怪在细节里啊。仔细看看这些人的名字不是民主党活动积极分子,就是在假新闻电视频道上指责政府做事的人,要么就是欧巴任命有极左意识形态人,这就不奇怪了,原来是反对力量大集合。再看看这几十个科学家,要分析他们与中国的基本利益历史,一定不奇怪,如果是天大错误,全球应当由超过几千科学家出来说吧?!笨脑子也可以向问题!

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  • 水蛇 回复 我叫小龙鱼

    【美国人也一样,拼命往中国头上泼脏水。】

    一个美国政客,代表不了美国人。

    全球27位科学家和专家联名发表声明,证明新冠病毒非人工合成。其中就有不少美国科学家和专家。

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  • 我叫小龙鱼 回复 体育老师

    【脸皮要多厚才能扛下去啊?】

    说得太好了!

    你脸皮要多厚才能扛下去啊?

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  • 我叫小龙鱼 回复 水蛇

    【俄罗斯咬定病毒人工制造。

    往美国头上泼脏水。】

    美国人也一样,拼命往中国头上泼脏水。

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    据《纽约时报》报道,阿肯色州共和党参议员汤姆·科顿(Tom Cotton)16日在福克斯新闻节目中,声称该病毒“有可能来自武汉一个生化实验室”。

    不过讽刺的是,科顿自己一边造谣一边却承认,“我们没有证据表明疫情就起源于那里”。

    而科顿在这一广泛被认为只是边缘理论的“阴谋论”遭到不少批评后,又在推特上改口说,他不一定认为这种病毒是“经过改造的生物武器”。他称这一说法只是假说之一,他还说病毒有可能是自然传播的。但他还是声称,病毒“不是来自武汉的食品市场”,同样,他没有拿出任何证据。

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